O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a capacidade do organismo de neutralizá-las. Esse desequilíbrio pode levar a danos celulares e comprometer a saúde dos organismos. Este estudo investiga os efeitos de combinações entre o rejeito de minério da Bacia do Rio Doce e a qualidade da água no estresse oxidativo em Astyanax lacustris. Os alevinos foram divididos aleatoriamente e expostos por 35 dias a quatro tratamentos distintos que variam entre a composição do substrato (arenoso ou rejeito de minério) e a qualidade da água (tratada ou do próprio rio). Foram coletados fígados, brânquias e testículos para análise de estresse oxidativo. Em todas as análises utilizamos ensaios colorimétricos por meio de espectrometria na detecção dos biomarcadores. Nos testículos, observou-se um aumento significativo nos níveis de óxido nítrico (ON) (p<0,0008) e atividade da glutationa S-transferase (GST) (p<0,0001) para os três tratamentos comparados ao grupo controle, indicando estresse oxidativo severo e resposta antioxidante. Nas brânquias, houve um aumento significativo nos níveis de proteínas carboniladas (PC) (p<0,0002) nos tratamentos com rejeito e ON (p<0,0035), apontando para um estresse oxidativo moderado e possíveis impactos na função respiratória. No fígado, não foram detectadas alterações significativas, sugerindo uma resistência ao estresse oxidativo ou eficácia dos mecanismos antioxidantes locais. Estes achados destacam a importância da qualidade ambiental na manutenção do equilíbrio redox e na saúde dos organismos aquáticos em ambientes contaminados por rejeitos de mineração.