Fatores locais e regionais conduzem a ecologia de riachos neotropicais, contudo seus efeitos em escalas espaciais amplas são pouco explorados. Avaliamos a ictiofauna de 250 riachos em três sub-bacias (Ivinhema, Amambai e Iguatemi, cobrindo 64.631 km²) da bacia do alto rio Paraná, a fim de compreender os mecanismos ecológicos que regem sua diversidade. Comparamos a riqueza de espécies estimada (bootstrap) entre as sub-bacias usando Kruskal-Wallis e medimos a importância das variáveis locais e regionais com uma árvore de inferência condicional. Resumimos a composição das espécies usando Análise de Coordenadas Principais (PCoA, índice de Jaccard), ajustada às variáveis ambientais. A riqueza de espécies foi maior no Ivinhema (112), seguido por Iguatemi (56) e Amambai (46), influenciada pelos fatores regionais sub-bacia e altitude, e, pelos fatores locais profundidade e largura do riacho. As variações na composição regional das espécies entre as três sub-bacias refletiram respostas funcionais espécie-específicas aos fatores ambientais. No Ivinhema, peixes bentopelágicos e pelágicos (Acestrorhynchus lacustris, Cyphocharax modestus, Eigenmannia trilineata e Gymnotus sylvius) se destacam em riachos fundos, enquanto áreas de maior altitude possuem espécies generalistas (Apistogramma commbrae, Farlowella hahni, Hemigrammus ora, Hyphessobrycon eques, Moenkhausia sanctaefilomenae e Serrapinnus heterodon). No Amambai, as espécies estão mais associadas a riachos rasos (Bryconamericus turiuba, Geophagus brasiliensis e Gymnotus inaequilabiatus), com pressão seletiva da altitude. No Iguatemi, a pressão competitiva por alimento e espaço seleciona espécies bentônicas ou bentopelágicas de diversos hábitos alimentares (Psalidodon bockmanni, Oligosarcus paranensis, Hypostomus sp., Phallotorynus pankalos, Pimelodus argenteus, Rineloricaria sp. e Cambeva davisi). Confirmamos que compreensão das comunidades de peixes de riachos do alto rio Paraná deve considerar as associações complexas entre escalas regionais e locais, além dos traços funcionais e relações filogenéticas das espécies. Temas como áreas de forrageamento, espécies introduzidas, impactos ambientais e eventos de captura de cabeceira e diversificação evolutiva são relevantes para pesquisas futuras.
