A bacia Tocantins-Araguaia é a maior bacia exclusivamente em território brasileiro e pode ser dividida em três trechos principais: o Alto Tocantins, o Baixo Tocantins e o Araguaia. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar e inventariar a ictiofauna da sub-bacia do Alto Rio Tocantins, preenchendo lacunas de riachos pouco amostrados em coleções científicas. Para o levantamento das espécies, foi feita uma investigação bibliográfica (utilizando as bases de dados Google Scholar e Web of Science), observados materiais depositados em coleções científicas, e realizadas coletas desde os limites Sul desta sub-bacia no Distrito Federal até o limites Norte, no Estado do Tocantins. No total, foram elencadas 491 espécies distribuídas em 11 ordens, 42 famílias e 201 gêneros ocorrendo na sub-bacia. Dessas, 70 espécies foram registradas nos materiais de coleção examinados, e 141 espécies coletadas nas expedições, que ocorreram entre abril de 2021 e janeiro de 2024, totalizando 60 pontos visitados. As ordens Characiformes e Siluriformes são as mais representativas na sub-bacia, com 240 espécies (49%) e 146 espécies (30%). Também foram constatados seis novos registros para a sub-bacia: Moenkhausia lopesi, Leporinus aff. paranensis; Phalloceros harpagos; Farlowella henriquei, Astyanax bockmanni e Eigenmannia dutrai. Nas coletas conduzidas foram capturadas três espécies exóticas para a sub-bacia do Alto Tocantins: Poecilia reticulata, Xiphophorus hellerii e Coptodon rendalli. Todos os pontos de coleta foram investigados para seus principais impactos, e pode se constatar grande influência de impacto derivado da agropecuária na região, além da ausência de fluxo de água em diversos locais, principalmente na drenagem do Rio Maranhão (no DF) e em riachos do Estado do Tocantins. Ademais, no Rio Azuis (no TO), diversos espécimes coletados apresentaram anomalias, com nadadeiras (peitoral e dorsal) e coluna vertebral encurtadas. As informações levantadas nesta pesquisa podem contribuir significativamente para um manejo e conservação mais eficaz da ictiofauna.